CTC富集的方法学

一、CTC 富集方法的分类和原理
 

CTC 的富集方法可以分为生物化学特性富集法（亲和性富集法）和物理特性富集法。

亲和性(生物特性)富集法主要是根据通过细胞表面特异性表达的蛋白质生物标志物分离靶细胞，包括正向捕获CTC 的阳性富集法和负向去除白细胞的阴性富集法。物理特性富集法主要是根据CTC 的大小、密度、力学和介电性能等物理特性将CTC 筛选出来。

二、CTC 富集技术的发展历程和趋势

2.1 发展历程

从技术发展史来看，CTC 富集技术分为三代：第一代为基于物理特性的粗分离技术，第二代为基于生化特性的免疫磁珠技术，第三代为基于物理或生化特性的微流控芯片技术。

2.1.1 基于物理特性的粗分离技术

基于物理特性的粗分离技术通过特殊滤膜装置、密度梯度离心将CTC 分离出来。这些技术操作简单成本低廉，不依赖细胞表面抗原的表达，捕获的细胞数量多，但是由于CTC 物理特性的异质性，难以富集到高纯度的CTC。

2.1.2 基于生化特性的免疫磁珠技术

基于生化特性的免疫磁珠技术通过免疫磁珠偶联的抗体或多肽正向或负向筛选出CTC。由于技术的限制，早期的磁珠只能达到微米级。随着纳米技术的发展，现在使用的磁珠大都为纳米级，其增大的比表面积增加了与待测细胞的接触几率，更好的分散性降低了对细胞造成的机械性压力，大大提高了CTC 的富集率。最典型的基于免疫磁珠富集CTC 的技术平台是强生子公司veridex 的CellSearch，其是全球目前唯一同时经过FDA 和CFDA 批准的用于CTC检测的商业化产品。该产品由于检测灵敏度不高，且无法分离活体CTC，2016 年初已停产。除了CellSearch 之外，也有多种技术平台基于免疫磁珠技术捕获CTC，如AdnaGen 公司（已被Qiagen 收购）的AdnaTest，Miltenyi 公司的MACS，Illumina 公司的MagSweeper。

用于CTC 检测的CellSearch 平台。（A）将血液吸入含有EDTA 和细胞保护剂的CellSave 保护管中;（B）将7.5mL 血液转移到单独的管中并离心以分离固体血液成分和血浆;（C）样品放入CELLTRACKS®AUTOPREP® 系统中，吸出血浆并将样品重悬于缓冲液中（; D）添加偶联EpCAM抗体的磁性纳米颗粒并与EpCAM 阳性细胞结合，从而“富集”上皮来源的CTC。然后将磁珠结合的细胞与其他细胞通过磁性分离;（E）CTC 用CK8，CK18 和CK19 抗体染色。CD45 阳性染色细胞被认为是白细胞，并被排除在分析之外;（F）应用DAPI 染色细胞核;（G）施加磁力以分离磁珠结合的EpCAM 阳性细胞;（H）CK 阳性、DAPI 阳性、CD45 阴性的细胞被认为是CTC 用于进一步分析。

2.1.3 微流控芯片技术

微流控芯片技术基于CTC 的物理特性或生化特性或两种特性的结合来富集CTC，所需样品量小、流速可控而且能够捕获活细胞。微流控芯片技术目前已经历了三代的发展过程：第一代芯片为以CTC-Chip 为代表，第二代芯片以HB-Chip 为代表，第三代芯片以CTC-iChip 为代表。
微流微柱富集：该类芯片基于CTC 与血细胞生化特性的差异，在芯片中设置微柱阵列将其从血液中分离出来。此类芯片以CTC-Chip 为代表，该芯片是第一个使用微流体技术富集CTC的装置。CTC-Chip 由78,000 个微柱阵列组成，微柱被识别EpCAM 的抗体包被，微柱的几何排列和流体流速被优化以促进细胞附着到抗体包被的柱上。除了CTC-Chip，也有一些公司开发基于微柱结构的芯片富集CTC，如Captura 公司的GEDI-Chip，Biocept 公司的OncoCEE。基于微柱结构的芯片由于复杂的微柱设计很难在大规模的基础上进行高通量生产。此外，目前用于CTC 检测和表征的技术严重依赖于免疫细胞化学和需要高分辨率成像的其他技术，这在非透明三维微柱阵列的存在下是困难的。

微流表面富集：由于基于微柱结构的芯片的局限性，表面捕获的微流体芯片被开发，这些芯片使用抗体包被的表面装置捕获CTC。表面捕获装置的简化架构更适合于大规模生产，并且还允许制造更易于成像的透明装置。此类芯片以HB-Chip 为代表，其微流道的结构为鱼骨形（HB），表面被识别EpCAM 的抗体包被，血液流过一个可视通道，通道内鱼骨形沟回能够引起血液的一个轻微斡旋，从而增强了其与抗体修饰表面的接触。与第一代CTC 芯片相比，第二代的HB 芯片制作更为简单，且可更高效地捕获肿瘤细胞，捕获效率约90%。后人在第二代的基础上加上了aptamer（结合CTC 表面的EpCAM），进一步提高了CTC 的捕获效率。
除了HB-Chip，GEM-Chip、GO-Chip 以及BioFluidica 公司的ModularSinusoidal Microsystem 也都采用表面装置捕获CTC。使用表面捕获装置的一个挑战是下游处理的灵活性，捕获的CTC被固定在装置的表面上，并且难以恢复以进行进一步分析。在胰蛋白酶消化后可以释放在这些装置中捕获的细胞，然而胰蛋白酶很可能切割用于后续分析的许多感兴趣的表面受体。
微流免疫磁珠富集：目前已经有多家公司或研究单位应用免疫磁珠技术来解决表面捕获装置的局限性，该技术能很好地控制细胞捕获与释放。此类芯片以CTC-iChip 为代表，该芯片将免疫磁珠和微流控技术结合起来用于CTC 富集。CTC-iChip 首先使用塑料微柱阵列将小个的红细胞和血小板过滤出去，然后在磁场中通过“惯性聚焦”作用将较大的细胞排成一行，并使用阳性或阴性富集方法分离CTC 与白细胞。CTC-iChip 的捕获效率可以高达98%，但是对于直径较小（<8 微米）的CTC 并不适用。除了CTC-iChip，也有多种芯片技术使用免疫磁珠富集CTC。如Ephesia 公司的Ephesia，Cynvenio 公司的LiquidBiopsy，Fluxion 公司的Isoflux，这些芯片的捕获效率与第二代芯片相近，为90%左右。
上述芯片主要基于CTC 的生化特性将其从血液中分离出来，具有特异性高的优点，能有效分选形状、大小相似的不同种类细胞。目前大部分技术采用EpCAM 作为CTC 的表面特异性抗原，但是在不同的肿瘤亚型中，EpCAM 的表达各不相同。依赖EpCAM 的CTC 分选芯片会丢失不表达或低表达EpCAM 的CTC，然而这些CTC 具有更大的浸润性和侵入性。因此，缺乏公认的表面标志物限制了亲和性富集在CTC 分选中的应用。

为了无需依赖表面标志物，也有一些微流控芯片基于物理特性富集CTC，目前主要有基于细胞大小和变形性差异的芯片技术，基于细胞力学性质的芯片技术和基于细胞介电性质的双向电泳技术。
基于细胞大小和变形性差异的芯片技术：该技术通过在芯片内部设计不同的小于CTC 直径的微孔、微过滤网、微柱等结构，当含有CTC 的样品流经芯片时，CTC 由于直径大而被卡在结构内，血细胞则随缓冲液一起流出，较大的白细胞被结构捕获时，由于CTC 比白细胞变形性小，加大缓冲液流速时，白细胞被冲走，CTC 则留在芯片内，从而达到分离目的。Abnova公司的ClearCell®CXSystem 就是基于此原理分离CTC 的代表，该系统还可以动态监测CTC 的捕获过程。芯片主要结构由圆柱形微柱构成，每个捕获单元由三个圆柱排列组成一个“爪形”结构。
基于细胞大小和变形性差异分选CTC 的优势在于：操作过程简单，捕获效率高，能够实现高通量富集，成本远远低于CellSearch，无需依赖表面标志物，分选出的CTC 可以用多种抗体进行标志物鉴别。该方法存在的问题是仅仅基于细胞尺寸和变形性不同而进行过滤式分选，由于CTC 尺寸和白细胞有重叠部分，CTC 有可能会通过滤网或微柱的间隔；而且在较大的机械力作用下，CTC 随着缓冲液流过微柱或者滤网时容易破裂。这些因素会对分离纯度和细胞活性造成一定影响，这类芯片在设计内部捕获单元时应避免使用带棱角的微柱，比如三角形、长方形、正方形等。
基于细胞力学性质的芯片技术：这些技术主要基于惯性力或确定性侧向位移。基于惯性力的惯性微流技术通过使用两种力（梯度剪切升力和管壁效应升力）在微流体装置中应用惯性效应，基于尺寸被动地将CTC 与其他血细胞分离。这些升力的大小和方向取决于通道尺寸，通道纵横比，流速和颗粒直径。目前该技术的商业化平台主要有Vortex（直线型通道）和ClearCellFX（单螺旋通道）。
基于确定性侧向位移设计的微流控芯片原理是芯片内具有相对于流体流动方向呈一定角度的微柱阵列，尺寸不同的颗粒在流动过程中具有不同的运动轨迹，尺寸大的颗粒会发生侧向位移向一侧汇聚，尺寸小的颗粒会按原轨迹运动，在芯片上设计相应的两个出口，即可收集到相应的细胞。
基于细胞力学性质差异分选同基于细胞大小和变形性差异分选一样，装置简单、无需复杂的实验设备、成本低。样品无需标记，不影响CTC 分子特性和表面标志物；细胞在微流环境中损伤小，分选后细胞的存活率更高，可继续培养和做后续分析。然而，由于血液的复杂性，细胞间的相互作用不容易控制，当处理细胞浓度较高的样品时，分选效率降低。另外，该方法单纯基于细胞的物理特性实现，而人体血液是高度复杂的血浆、红白细胞、血小板、蛋白质混合物，且血液黏度是水的3 倍以上，因此芯片有时容易发生堵塞现象，影响分选效率，分选出的CTCs 可能存在假阳性结果。
基于细胞介电性质的双向电泳技术：双向电泳（DEP）是微流控芯片上一种常用的细胞分选方法，其原理是不同类型的细胞在电场中介电性质不同，所受介电力的大小和方向不同，在不同介电力作用下向不同方向移动，在电场中实现目的细胞的分选。目前，商业化的双向电泳技术主要有ApoCell 公司的ApoStream，SiliconBiosystems 公司的DEPArray。

双向电泳法最大的优势是可将不同癌种表面标志物表达相同、尺寸相似、形态相似的细胞分离出来。但是在较大的流速下，微弱的电泳力没有充足时间感应流过的CTC，从而难以达到快速分选。该方法存在的另一个问题是电场力可能会对细胞活性和表面特性产生影响，不利于对CTC 进行后续培养和分子特性分析。双向电泳法分选时间长，但准确率高，因此，较适合于少量细胞的分选。

CTC 富集技术的发展历程

2.2 发展趋势

2.2.1 微流控芯片技术有望得到更广泛应用

微流控芯片技术由于其自身特点在细胞分选方面具有一定的优势，包括芯片体积小、速度快、通量高、操作简便、样品和试剂消耗低、易在芯片上集成多用途功能部件等．经过十多年的发展，该技术已经在CTC 分选中越来越广泛的应用，有望在将来成为CTC 富集和检测工具之一。该技术目前也面临着一些技术上和临床上的挑战：芯片通道空间小，实验过程中管道容易被堵塞；有些特殊的芯片造价昂贵不便于推广应用；在进行细胞分选时，有些方法难以确保较高的细胞活性；缺乏统一的CTC 表面标志物等．如何改进微流控芯片技术在进行细胞分选时所遇到的上述问题，充分发挥其优势，将是接下来研究的关键。

2.2.2 开发纳米技术和适配体在微流控芯片中的应用

CTC 检测的灵敏度和可靠性非常重要，7.5ml 血液中有1～5 个CTC 在临床上都是有意义的，假阴性和假阳性都可能对样品分析、临床诊断产生重要影响。随着纳米技术的不断发展，功能化纳米材料修饰的微流控芯片广泛应用于CTC 的富集和检测。抗体连接的功能性纳米粒子能够为CTC 与抗体的结合提供更大的接触表面积，因此纳米技术也成为细胞分选中备受瞩目的一项新技术。适配体能提供特异性CTC 靶点，因此微流控芯片的应用也许可以向基于新的CTC 捕获探针（如核酸适配体探针等）方面发展，寻找特异性强的适配体探针，以提高CTC检测的可靠性。

2.2.3 基于多种捕获方法设计微流控芯片

亲和性富集法特异性高，能有效分选形状、大小相似的不同种类细胞，但是阳性富集法大都使用EpCAM，会丢失不表达或低表达EpCAM 的CTC，而阴性富集法只是去除了白细胞，CTC纯度不高。物理特性富集法不依赖细胞表面标志物的表达，捕获的细胞数量多，能够克服CTC 在蛋白表达上的异质性，但是无法克服CTC 在物理特性的异质性。因此，采用多种捕获方法相结合，充分利用各自的优点设计CTC 捕获微流控芯片是将来的发展趋势。如第三代芯片CTC-iChip，其利用确定性侧向位移、惯性聚焦和免疫磁珠富集CTC。

1.1 亲和性富集法

亲和性富集法根据结合的靶细胞是CTC 还是白细胞，可分为阳性富集法和阴性富集法。

阳性富集法主要利用特异性抗体与肿瘤细胞表面抗原进行特异性结合来富集CTC。CTC 分为上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮间质细胞混合表型，因此用于CTC 阳性富集的特异性抗体分为识别上皮标志物、识别间质标志物和识别上皮间质标志物三种。其中，上皮标志物在正常上皮细胞和上皮肿瘤（即癌）上表达，但在间质白细胞上不存在，因此经常用于区分癌细胞和正常血细胞。上皮细胞粘附分子（EpCAM）是最常用于上皮表型CTC 阳性富集的细胞表面标志物。此外，由于细胞骨架蛋白对于上皮细胞具有特异性，细胞角蛋白家族成员（即CK8，CK18 和CK19）已经成为检测具有上皮表型癌症患者CTC 的“金标准”标记物。

阴性富集法也称白细胞去除法，通常用识别CD45 或CD14 的特异性抗体与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞。

除了特异性抗体，亲和性结富集法的某些技术采用与CTC 或白细胞表面抗原特异性结合的多肽或适配体（aptamer，一种单链DNA 或RNA 分子，与目的蛋白有很高的亲和力和特异性）替代抗体来实现阳性或阴性富集。

1.1.1 免疫磁珠技术

亲和性富集法目前基于免疫磁珠技术和微流控芯片技术对CTC 进行富集。免疫磁珠技术是根据免疫亲和的原理，将免疫磁珠与捕获抗体或特异性多肽（可与血液中的CTC 或白细胞表面抗原相结合）相连接，随后通过磁场即可将磁珠捕获与未捕获的细胞分离。

1.1.2 微流控芯片技术

微流控（microfluidics）是一种精确控制和操控微尺度流体，以在微纳米尺度空间中对流体进行操控为主要特征的科学技术。微流控芯片是微流控技术实现的主要平台和技术装置，因其样品量小、流速可控及构件透明性等特点，已被广泛应用于CTC 的分选富集中。微流体芯片技术基于亲和性富集法分离CTC 时，芯片内部的微通道或微结构上修饰能够与CTC 或白细胞表面抗原结合的特异性抗体或适配体，当血液流经芯片时，特异性抗体或适配体可与目的细胞表面抗原结合，随后将CTC 或白细胞粘附在芯片上，实现CTC 的阳性捕获或阴性富集。

1.2 物理特性富集法

物理特性富集法根据物理性质来分离CTC，包括大小、密度、力学和介电性质。从大小上来看，CTC 的直径约为10-20μm，而血细胞大小为7-12μm，通过过滤可留下体积较大的CTC。从密度上来看，CTC 的密度较白细胞和红细胞密度小，通过密度梯度离心可实现CTC 分离。除了大小和密度的差异，一些技术也利用CTC 和血细胞之间的力学和介电性质差异来捕获CTC。具体来说，CTC 的可变形性不及血细胞。另外，CTC 的膜电容通常较血细胞低，在一定强度的电场中，其迁移率与血细胞会产生差异。微流控技术除了在亲和性富集法中有广泛应用外，在物理特性富集法中也有应用。微流控芯片根据CTC 与血细胞物理特性的差异，通过在芯片中设置不同的微结构单元将其从血液中分离出来，常用的微结构包括微孔、微过滤网和微柱等。

1.3 生化和物理特性相结合的方法

此外，也有一些技术将CTC 的物理和生物化学特性结合起来用于CTC 富集。如CTC-iChip，其基于CTC 大小和表面标志物的表达情况进行CTC 富集。该技术首先根据细胞大小，将较小的红细胞和血小板过滤出去，留下白细胞和肿瘤细胞。然后，用识别EpCAM 的磁珠偶联抗体对CTC 进行免疫染色，在磁场中捕获并收集在芯片上。或者用识别CD45 的磁珠偶联抗体去除白细胞后收集CTC